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T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)活性定量檢測試劑盒介紹
檢測原理：
T7 RNAP活性是T7表達系統的重要參數，其活性大小直接影響到T7表達系統對外源基因的轉錄(mRNA制備)和表達(重組蛋白的制備)的效果。對于T7 RNAP活性的檢測，尤其是在混合液(制備mRNA的反應液、細胞破碎液等)中的T7RNAP活性原位檢測由于干擾因素過多，很難實現T7 RNAP的定量檢測。本試劑盒是利用了T7表達系統的特異性，在特殊的體系中將T7RNAP活性含量與表達的綠色熒光蛋白量關聯起來，通過檢測熒光響應值定量計算出T7 RNAP活性。檢測原理流程如下[1]：
適用體系：
試劑盒所用反應試劑是經過幾十種成分優化并添加了獨特的抗干擾試劑制備而成，對樣品中存在的其它物質有很好的抗干擾能力。所以與以往檢測T7 RNAP活性的方法不同，本試劑盒不但可以測定純化的T7RNAP樣品，還可以直接測定混合物中含有T7 RNAP的樣品，其中包括：
① 測定純化的T7RNAP溶液中T7 RNAP活性含量
② 測定用T7轉錄系統制備mRNA過程中反應液中的T7 RNAP活性含量
③ 測定表達了T7 RNAP菌體樣品中的T7 RNAP活性含量
應用場合：
l 本試劑盒可以用于制備T7 RNAP過程中，純化的T7 RNAP試劑樣品的質量監測
l 為T7表達系統表達外源蛋白過程的分析提供T7 RNAP活性含量定量數據
l 指導T7獨立表達系統的理性構建
l T7表達系統為基礎的無細胞催化研究中反應條件的優化及反應過程分析
l T7 RNAP基因突變以及分子定向進化對T7 RNAP活性的影響研究
l mRNA制備過程的工藝優化及生產質量監控
l mRNA疫苗制備和生產過程工藝條件優化和質量控制等
T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)活性定量檢測試劑盒使用說明
檢測原理：
T7 RNAP活性是T7表達系統的重要參數，其活性大小直接影響到T7表達系統對外源基因的轉錄(mRNA制備)和表達(重組蛋白的制備)的效果。對于T7 RNAP活性的檢測，尤其是在混合液(制備mRNA的反應液、細胞破碎液等)中的T7RNAP活性原位檢測由于干擾因素過多，很難實現T7 RNAP的定量檢測。本試劑盒是利用了T7表達系統的特異性，在特殊的體系中將T7RNAP活性含量與表達的綠色熒光蛋白量關聯起來，通過檢測熒光響應值定量計算出T7 RNAP活性。檢測原理流程如下[1]：
適用體系：
試劑盒所用反應試劑是經過幾十種成分優化并添加了獨特的抗干擾試劑制備而成，對樣品中存在的其它物質有很好的抗干擾能力。所以與以往檢測T7 RNAP活性的方法不同，本試劑盒不但可以測定純化的T7RNAP樣品，還可以直接測定混合物中含有T7 RNAP的樣品，其中包括：
④ 測定純化的T7RNAP溶液中T7 RNAP活性含量
⑤ 測定用T7轉錄系統制備mRNA過程中反應液中的T7 RNAP活性含量
⑥ 測定表達了T7 RNAP菌體樣品中的T7 RNAP活性含量
應用場合：
l 本試劑盒可以用于制備T7 RNAP過程中，純化的T7 RNAP試劑樣品的質量監測
l 為T7表達系統表達外源蛋白過程的分析提供T7 RNAP活性含量定量數據
l 指導T7獨立表達系統的理性構建
l T7表達系統為基礎的無細胞催化研究中反應條件的優化及反應過程分析
l T7 RNAP基因突變以及分子定向進化對T7 RNAP活性的影響研究
l mRNA制備過程的工藝優化及生產質量監控
l mRNA疫苗制備和生產過程工藝條件優化和質量控制等。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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保存條件
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A101-1
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A101-2
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A101-3
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規格
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20次
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50次
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100次
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試劑A
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-20℃以下
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約155µL
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約390µL
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780µL
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試劑B
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-20℃以下
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約132µL
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約330µL
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約660µL
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試劑C
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-20℃
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約50µL
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約125µL
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約250µL
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T7 RNAP標準品(10U/µL)
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-20℃以下
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30µL
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70µL
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135µL
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注：測定次數是指：包括用于標準曲線法標準樣品的測定、比例法標準樣品的測定和待測樣品的測定所用試劑次數總和。
試劑盒配套的T7 RNAP標準品是按照檢測次數十分之一的量提供。
本試劑盒所用T7RNAP聚合酶標準品溶液是經過特殊處理的，專門為本試劑盒配套使用的，市售的T7 RNAP無法在本試劑盒中定量使用。
檢測步驟
1） 試劑盒中的試劑盡量避免反復凍融，以免喪失活性。第一次使用時，將試劑盒中的全部試劑分別在冰水浴中融化，根據用戶自己每次測定樣品的個數分裝成合適體積，按照試劑盒的保存條件冷凍保存。
2） 取出分裝好的試劑A、B、C和T7 RNAP標準品，置于冰浴中融化，分別取7µL試劑A，6µL試劑B和2µL試劑C加入到同一個經過冰浴冷卻的1.5mL的塑料離心管中，并保持離心管一直在冰浴環境，根據樣品中T7 RNAP活性含量，向上述離心管中加入1-5µL待測樣品(待測樣品需要將T7 RNAP活性含量稀釋一定的倍數至檢測活性范圍內)，不足5µL的部分用無菌去離子水補足到5µL。
3） 將上述加入了總共20µL溶液的1.5mL離心管混勻，并在4℃，1000rpm下離心1分鐘，然后放入34℃水浴搖床上反應60min。待反應時間結束時，快速加入980µL冰冷的經過滅菌的去離子水混勻，得到熒光待測液，并放置在冰水浴中。
4） 為了定量計算T7 RNAP活性，在測定樣品時，需要同時按照1）~3）的步驟做一個加入T7 RNAP標準品的樣品檢測。
5） 分別取200µL步驟3）中的熒光待測液(包括步驟4)的標準品熒光待測液)至黑色Costar 96孔板，用熒光酶標儀在激發波長460nm，發射波長510nm，增益值為100情況下測定熒光值。與步驟4）標準品樣品的熒光值進行比較，按比例計算出樣品T7 RNAP活性值。
6） 建議：為了保證測定數據的穩定性，建議一次測定多個樣品，同時進行一個T7 RNAP標準品的檢測作為參比值，先計算所需要試劑的總體積，然后將試劑A、B和C混合，分別取15µL加入到1.5mL塑料離心管中，再按照實驗的需要加1-5µL待測樣品。
參考文獻：
[1] Mingxin Cui, Okei Wong, Qiang Li, Wenya Wang, An Assay Method for Characterizing Bacteriophage T7 RNA Polymerase Activity by Transcription–Translation (TX-TL) System, The Journal of Biochemistry, 2023;, mvad002, https://doi.org/10.1093/jb/mvad002
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